Категории

Структурно-функциональные свойства гемагглютинина и нейраминидазы различных штаммов вируса гриппа н9n2 (реферат) часть 2

10.07.2018

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Определить нуклеотидные последовательности РНК в участках генов HА и NА, а также первичную структуру соответствующих областей этих белков, отвечающих за их функциональные власивости, для различных изолятов вируса гриппа Н9N2, полученных в птицеводческих хозяйствах Израиля у кур, индеек, гусей, страусов в период эпизоотии 2000 — 2004 лет.
  2. Изучить скорость, степень и константы связывания НА в этих штаммов вируса гриппа Н9N2 с клетками млекопитающих и птиц in vitro.
  3. Исследовать температурную зависимость ферментативной активности NA в этих штаммов вируса гриппа Н9N2 in vitro.
    Смотреть онлайн Битва экстрасенсов 19 сезон

  4. Установить возможную корреляцию между разницей функциональной активности HА и NА и особенностями их первичных структур в этих штаммов вируса гриппа Н9N2, а также выявить эволюционные изменения, которые могут в наибольшей степени способствовать переходу вируса от птиц к млекопитающим .
  5. На основе изученных первичных структур построить эволюционное дерево этих штаммов вируса гриппа Н9N2 и выделить в нем штаммы, которые потенциально наиболее способные переходить к млекопитающим.
Объект исследования — связь между эволюционными изменениями первичной структуры РНК в генах HА и NА и структурно-функциональными свойствами этих белков. Предмет исследования — нуклеотидные последовательности РНК, аминокислотные последовательности HА и NА, их адсорбцийнi, ферментативные и антигенные свойства, эволюционные связи между штаммами вируса гриппа Н9N2. Методы исследования — полимеразная цепная реакция — ПЦР, электрофорез в агарозном геле, секвенирование ДНК и определение аминокислотных последовательностей НА и NА, методы измерения функциональных свойств этих белков (реакции торможения гемаглютинацийнои и нейраминидазнои активностей, определение скорости адсорбции и коэффициента связывания вируса с монослойный культурой клеток почек собаки и куриными эритроцитами, спектрофотометрических определения удельной активности вирусной NА), построение эволюционного дерева штаммов вируса гриппа Н9N2. Научная новизна полученных результатов. Впервые определены первичные структуры участков генов HА и NА и соответствующие им аминокислотные последовательности, обусловливающих функциональные свойства этих белков, которые были изъяты из 61 штамма вируса гриппа птиц H9N2 в течение эпидемической вспышки этой болезни в 2000 — 2004 г. г. На основании полученных данных проведено систематическое исследование молекулярных механизмов эволюции вируса H9N2 за 4-летний период. Показано, что эволюция вируса гриппа в ходе эпизоотии шла не путем постепенных изменений от первоначального варианта к конечному, а путем появления ряда форм, отличающихся как друг от друга, так и от первоначального варианта. Впервые показана связь между конкретными мутациями в нуклеотидному составе генов HА и NА, соответствующими аминокислотными изменениями и функциональной активностью этих белков — скоростью и степенью адсорбции вируса на клетках и температурным оптимумом действия NА. Полученные данные впервые демонстрируют структурно-функциональные свойства молекул HА и NА, играющих решающую роль во взаимодействии возбудителя болезни и хозяина и позволяют вирусу гриппа птиц H9N2 переходить в резервуар млекопитающих. Впервые описано варианты вируса H9N2, которые являются наиболее подходящими кандидатами для перехода на млекопитающих, в том числе и на людей. Теоретическое и практическое значение полученных результатов. С теоретической точки зрения, полученные результаты дополняют современные представления о молекулярных основах эволюции вирусов гриппа и важны для понимания процессов, позволяющих вирусам переходить от птиц к млекопитающим. В частности, они раскрывают связь между мутационные изменения в генах и структурно-функциональными свойствами белков, ответственных за взаимодействие вируса с клетками хозяев, принадлежащих к различным систематическим группам организмов. Полученные данные позволяют также разработать молекулярные критерии возможности различных вариантов вируса птичьего гриппа переходить на млекопитающих и людей. Практическое значение диссертационной работы заключается прежде всего в том, что они могут быть полезными для предсказания появления новых штаммов вируса гриппа с повышенной способностью инфицировать организм человека. Данные о эволюционные изменения первичной структуры и антигенные свойства поверхностных белков вируса могут быть использованы для планирования и ускорения создания новых вакцин, в частности, для рекомендации выбора новых вирусных штаммов, которые могут обеспечить максимальную защитную реакцию организма животных и человека от гриппа. Полученные результаты используются в учебном процессе при преподавании спецкурсов «Физиологические и биохимические основы адаптации», «Молекулярные основы иммунологии» и «Молекулярные механизмы эволюции» на биологическом факультете Харьковского национального университета им. В. Н. Каразина. Личный вклад соискателя. В соответствии с поставленных целей и задач работы, автором самостоятельно выполнены запланированный объем экспериментальных исследований, расчеты эволюционных отношений исследованных штаммов вируса гриппа, анализ научной литературы, сделанная статистическая обработка фактического материала. Планирование направлений исследований и интерпретацию полученных результатов проведено совместно с научным руководителем. Изоляцию вирусов и оценку их патогенности была проведена совместно с сотрудниками Ветеринарного института Кимрона (Бейт-Даган, Израиль), что отражено в совместных публикациях. В диссертации не использованы идеи или разработки, которые принадлежали бы соавторам опубликованных научных работ. Апробация результатов диссертации. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ХIII Конгрессе всемирной ветеринарной ассоциации птиц (Денвер, Колорадо, 2003 г.); ежегодном съезде Израильского общества микробиологов (Тель-Авив, 2003 г.); XII Международном конгрессе иммунологов и IV ежегодной Конференции иммунологов (FOCIS) (Монреаль, Канада, 2004 г.); научной конференции, посвященной 70-летию кафедры генетики и цитологии Харьковского национального университета им. В. Н. Каразина (Харьков, 2004 г.); V Интернациональном симпозиуме по заболеваниям птиц (Берлин, Германия, 2004 г.); IX Украинский биохимическом съезде (Харьков, 2006 гг.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, среди которых 6 статей в журналах и 8 тезисов докладов. Структура и объем диссертации . Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4-х разделов результатов исследования и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы (из 194 источников). Работа изложена на 144 страницах печатного текста и содержит 18 рисунков и 26 таблиц. Основное содержание работы Материалы и методы исследований. Исследования проведены на 61 штамме вируса гриппа H9N2, выделенных в птицеводческих хозяйствах Израиля в период эпизоотии 2000 — 2004 г. г. Референтные штаммы птичьего {ty / wisconsin-66 — (H9N2)} и человеческих {Singapore / 57 — (H2N2) и Hong Kong / 68 (H3N2)} вирусов гриппа были любезно предоставлены доктором Скехелом.